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铅对大鼠海马CA1和CA3区Bcl  2阳性细胞影响

【摘要】  目的 了解海马各区Bcl2阳性细胞在铅神经毒机制中的作用。方法 采用免疫组化(ABC)法观察腹腔注射130mg/kg醋酸铅溶液大鼠12和24h后海马CA1区和CA3区Bcl2阳性细胞数目的变化。结果 染铅12和24h大鼠海马CA1区Bcl2阳性细胞数目(分别为126.05±33.21和(57.45±37.66)与对照组比较(201.94±31.72)明显减少(P>0.05,或P<0.01),但各组大鼠海马CA3区及其他组的CA1区Bcl2阳性细胞数与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 染铅大鼠海马CA1区Bcl2阳性细胞数目减少可能与铅的神经毒作用有关。
【关键词】  铅
  有文献报道,铅的神经毒性可能和脑细胞凋亡有关〔1,2〕。近年来研究表明,海马结构各亚区的Bcl2基因表达异常可能是铅触发海马神经细胞凋亡发生的主要介导因素〔3〕。目前发现,Bcl2(B cell lymhona/leuRenia2)基因在细胞凋亡调控过程中起着重要作用,Bcl2蛋白不仅具有抗淋巴细胞凋亡作用,也具有抗神经细胞凋亡的作用〔3〕。张荣〔4〕等采用流式细胞仪研究发现,染铅与脑细胞发生凋亡率有剂量反应关系,与Bcl2含量呈现负相关。但染铅对海马不同亚区Bcl2蛋白表达的影响,目前尚不清楚。本研究采用免疫组化法观察染铅不同时点大鼠海马CA1区和CA3区Bcl2阳性细胞数目的动态变化,以了解铅对海马各区细胞的影响。
  1  材料与方法
  11  实验动物及处理  选用刚断乳健康Wistar大鼠30只,雌雄各半(天津市劳动卫生研究所)。自由饮水、普通饲料适应性喂养3d。随机分为对照组和染铅3,6,12和24h组共5组,每组6只(雌雄各半),一次性腹腔注射进行染毒:(1)染铅组:130mg/(kg·bw)的醋酸铅水溶液;(2)对照组:等体积09% NaCl。
  12  实验方法 
  121  取材和切片  染铅组大鼠分别于染毒3,6,12,24h结束时腹腔注射戊巴比妥钠(60mg/kg)麻醉,开胸,夹闭腹主动脉,经左心室插管,用37℃生理盐水100~150ml快速冲洗后,以含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液(PBS)(01mol/L,pH74)灌注固定,迅速取脑后,置多聚甲醛中继续固定7~9h(4℃),移入20%蔗糖溶液浸泡12h以上。恒冷箱连续冰冻切片(片厚为50μm),进行Bcl2免疫组化反应。
  122  Bcl2免疫组化反应  切片移入37℃ TritonH2O2中反应30min,PBS缓冲液漂洗后以3%正常羊血清封闭30min,然后加Bcl2一抗(1:200),4℃温盒内孵育72h后,免疫组化法(ABC)显色,常规裱片,脱水,透明,封片。
  123  结果判断  Bcl2阳性细胞显棕色或棕色反应颗粒,不显色为阴性反应;以Bcl2阳性的癫痫大鼠海马切片为阳性对照,以正常羊血清代替Bcl2一抗作为对照,结果为阴性反应;以01mol/LPBS(pH 74)代替Bcl2一抗为空白对照,结果为阴性反应。
  124  Bcl2阳性细胞计数  每组选取对应断面的海马脑片15张(每只动物取2~3张),采用尺型计数器在相同放大倍数(×200)的光镜下,分别计数CA1和CA3区每毫米的阳性细胞数。
   13  统计分析  采用SPSS80软件进行分析。
  2  结果
  21  不同染铅时间海马区光镜下观察结果  光镜下,海马结构各区存在Bcl2反应阳性神经元;染铅3h时,海马各亚区均无明显变化;染铅6h时,海马CA1和CA3区Bcl2阳性细胞显色稍加深,阳性细胞数有所增加;染铅12h时,海马CA1区阳性细胞显色明显变浅,阳性细胞数明显减少,而CA3区未见明显变化;染铅24h,海马CA1区与12h比较Bc12阳性细胞显色加深,阳性细胞数渐增多,但较对照组的阳性细胞数少,显色强度弱,而CA3区未见明显变化。
  22  不同染铅时间海马区阳性细胞数组间比较(表1) 
  表1  不同染铅时间大鼠海马各区Bcl2阳性细胞数比较(略)
  注:与对照组比较,* P<005,** P<001;脑片数=15
  3  讨论
  有报道〔2,4〕,染铅大鼠大脑皮层、海马和小脑细胞凋亡率均明显高于对照组,Bcl2蛋白是一种神经保护蛋白,其抗凋亡作用与其抗氧化作用有关〔5〕。张荣等发现,大鼠染铅5d后,皮层、海马和小脑Bcl2基因表达下降,Bcl2含量与染铅剂量呈相关〔4〕。鉴于细胞凋亡对于胚胎发育、维持细胞总体数量等过程都具有重要作用,所以脑细胞的凋亡必然会对中枢神经的结构和功能造成损伤。铅对于海马不同亚区神经元的代谢及功能如LTP的影响不同〔6〕,推测铅对海马不同亚区Bcl2阳性细胞的影响可能不同。进一步研究染铅对海马不同亚区Bcl2蛋白表达的影响,将对深入了解铅干扰学习记忆机制提供重要依据。本研究于大鼠染铅12h后,观察到海马CAl区Bcl2阳性细胞数目明显减少(P<001),24h时仍处于较低水平(P<005),而在不同时间染铅组与对照组间海马CA3区Bcl2阳性细胞数差异已无统计学意义(P>005)。铅的神经毒性作用尤其是对学习记忆影响的机制相当复杂,铅对海马不同亚区Bcl2蛋白表达的不同影响仅仅是其分子机制的一个环节,完全阐明铅神经毒性,尤其是对学习记忆影响的机制尚需深入研究,但铅对海马不同亚区Bcl2蛋白表达的不同影响说明其作用机制与海马CAl区细胞凋亡保护基因的蛋白表达水平下调有关。【参考文献】
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  〔6〕 王静,李积胜,张进,等.铅对大鼠海马一氧化氮合酶活力表达的影响[J].中华劳动卫生职业病杂志,2000,18(4):204-206.

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