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慢性铅暴露对小鼠pCREB蛋白表达的影响

来源:铅中毒网 作者:文涛,刘…
【摘要】  目的 探讨铅对小鼠海马磷酸化环磷酯腺苷(cAMP)反应成分结合蛋白(pCREB)表达的影响。方法 小鼠出生第1d起染铅组母鼠开始通过饮水饲以24,48,96mmol/L浓度醋酸铅。幼鼠出生后,先通过哺乳接触铅,断乳后则自行饮用与母鼠饮用浓度相同的含铅水。分别在14,28,42,56d处死小鼠,用蛋白免疫印记法观察各组小鼠海马区pCREB蛋白表达状况。结果 慢性铅暴露小鼠脑海马pCREB蛋白的表达总体上呈现下降趋势,与对照组比较,24mmol/L铅暴露使14d小鼠pCREB蛋白表达升高,但差异无统计学意义(P>005);而48,96mmol/L铅暴露组pCREB蛋白表达一直维持在较低的水平,差异有统计学意义(P<005)。结论 铅扰乱pCREB蛋白正常表达。
【关键词】  铅
  铅是工业应用最广泛的重金属之一,在自然界中广泛存在,居住环境中的生活性铅污染严重危害着人类的健康,尤其是儿童铅中毒流行比率远远高于成人,明显影响儿童的智力发育。本研究旨在通过观察慢性醋酸铅染毒小鼠海马磷酸化环磷酸腺苷(cAMP)反应成分结合蛋白(pCREB)表达的影响来探讨慢性铅中毒分子机制。
  1  材料与方法
  11  材料  昆明系小白鼠(中国医科大学实验动物部),雌雄2∶1,体重28~34g。分析纯醋酸铅和硝酸纤维素膜(中国实验原平皓公司)。十二烷基硫酸钠(SDS)(华美生物技术公司)。牛血清白蛋白(联星生物工程公司)。pCREB-抗(美国Cell Signaling公司)。辣根过氧化物酶(HPR)标记的驴抗兔标记的第二抗体(北京中山生物技术有限公司)。低温离心机F218型(美国Sigma公司)。
  12  方法  (1)染毒方法及剂量:按每笼雄∶雌为1∶2自然交配。将受孕母鼠所生小鼠随机分为4组,每组10只,共40只;对照组和24,48,96mmol/L染铅组。从小鼠出生第1d起染铅组母鼠开始通过饮水饲以不同浓度(24,48,96mmol/L)醋酸铅水溶液。对照组母鼠饮用自来水。为确保相同的营养条件,每个母鼠最多喂养10只胎鼠。断乳后幼鼠开始自己饮用与其母鼠相同的饮用水。于出生后第14,28,42,56d解剖小鼠取出脑海马,放入液氮中,转存到-70℃冰箱中。(2)蛋白免疫印记法:将收集的样品放到4℃预冷的裂解缓冲液中,4℃超声混匀(6s,6次),4℃震荡60min,离心25000g,60min,取上清分装。用酚试剂法测蛋白,以牛血清蛋白为标准品。用10%的十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)分离蛋白质,每孔蛋白加样量为40μg。常规蛋白免疫印迹法测定pCREB含量。将蛋白印迹显影图扫描,再应用Chemi Imager 5500 V203图像分析软件对结果进行分析。灰度值代表酶含量,以不同天数对照组的灰度值为100,其余各组与相应天数的对照组比较。
  13  统计分析  采用SPSS 110软件进行单因素方差分析。
  2  结果
   21  慢性铅暴露对小鼠血铅和脑海马铅含量的影响  于小鼠出生后42d对血铅和脑海马铅含量进行测定,各慢性染铅组小鼠血铅和脑海马铅含量均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<001),升高的程度与饮用水的铅浓度呈正相关,见表1。
       
        表1  小鼠血铅、海马铅浓度(略)
  注:与对照组比较,a P<001;与同时期24mmol/L组比较,b P<001;与同时期48mmol/L组比较,c P<001

  22  蛋白免疫印迹检测pCREB结果  本实验所用的一抗具有特异识别CREB的磷酸化Ser133特性,所以实验的灰度值代表pCREB。将实验后的电泳图扫描后,以不同天数对照组的灰度值为100,其余各组与同时期天数的对照组比较。结果发现,除14d低剂量组外,差异均有统计学意义(P<001)。低剂量组铅暴露对小鼠pCREB蛋白表达42d前呈现下降趋势,且只有14d低剂量组略高于对照组。中剂量组鼠pCREB蛋白表达与同时期低剂量组比较只有14d差异有统计学意义(P<001)。高剂量组鼠pCREB蛋白表达与同时期低剂量组相比较只有14,56d差异有统计学意义(P<001)。各组pCREB蛋白表达与其自身14d比较差异无统计学意义。中、高剂量组分别在14和42d达谷底,分别下降了4294%和4221%,见表2,图1。

  表2  慢性铅中毒对pCREB蛋白表达的影响(略)
  注:与同时期的对照组比较,a P<001;与同时期24mmol/L组比较,b P<001


  图1  Western Blots检测pCREB结果(略)


  3  讨论
  从无脊椎动物到哺乳类动物,在长时程记忆的编码方面有共同的分子机制,其中转录因子cANP反应元件结合蛋白性氨基酸亮氨酸拉链转录因子家庭,它有2种形式:具有(CREB)在长时记忆过程中起着关键性的作用〔1〕。CREB属于碱转录活性的二聚体和无转录活性的单体。其133位的丝氨酸残基(Ser133)可被蛋白激酶A(PKA)或钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)等磷酸化,磷酸化后的CREB(pCREB)形成同源二聚体或与CREB/ATF(激活转录因子1)家庭的其他成员形成异二聚体,使CREB活化,与cAPM的应元件(CRE)结合,调控靶基因(如cfos,cjun等)的转录〔2〕。本实验结果显示,除14d低剂量组外,各组pCREB均比同时期的对照组低,其他时间点都随铅浓度的增加而降低,与我们以前实验的CaMKⅡ蛋白表达变化规律相似〔3〕,表明其都具有铅的浓度依赖性降低。根据结果推测,铅通过抑制海马N甲基D天冬氨酸(NMDA)等钙离子通道及其受体,影响胞内钙离子稳态失衡和CaMKⅡ和N甲基D天冬氨酸受体(NMDAR)的正常结合〔4〕,抑制腺苷酸环化酶〔5〕,影响CaMKⅡ、PKA等的激活状态,干扰pCREB蛋白活性,cfos,jun基因表达和新蛋白质的合成,导致影响正常的学习记忆功能〔6〕。
    【参考文献】
   〔1〕 Frank DA,Greenberg ME.CREB:A mediaton of longterm memory from mollusks to mammals[J].Cell,1994,79:5-8.
  〔2〕 Pietruck C,Xie GX,Sharma M,et al.Multiple splice patterns of cyclic AMP response elementbinding protein mRNA in the central nervous system of the rat[J].Brain Res Mol Brain Res,1999,69(2):286-289.
  〔3〕 文涛,孙黎光,宗志宏,等.慢性铅暴露对小鼠CaMKⅡ蛋白表达的影响[J].中国公共卫生,2006,22(10):1211-1212.
  〔4〕 高明奇,孙黎光,周彬,等.慢性铅暴露小鼠海马NMDAR亚单位基因表达[J].中国公共卫生,2006,22(5):574-575.
  〔5〕 阮迪云.铅对儿童学习记忆的影响及其细胞和分子机理[J].中国药理学与毒理学杂志,1997,11(2):97-98.
  〔6〕 文涛,孙黎光,宗志宏,等.铅对小鼠海马区cjun表达及学习记忆功能的影响[J].中国公共卫生,2005,21(2):183-184.

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